Histoire de la découverte du CRISPR-Cas9. Tout a commencé en 1987, lorsque Yoshizumi Ishino et ses collègues ont accidentellement cloné et séquencé une portion inhabituelle d'ADN dans le gène iap d' Escherichia coli. Cette séquence contenait des répétitions d'ADN, mais à l'époque, leur signification était inconnue et elles ont été considérées comme une curiosité. Dans les années 1990, des séquences répétées similaires ont été trouvées dans de nombreux autres microbes, en particulier des archées et des bactéries. Francisco Mojica, un scientifique espagnol étudiant les archées Haloferax mediterranei, a joué un rôle décisif dans la compréhension de ces répétitions. Il a remarqué que ces séquences répétées étaient entrecoupées de séquences variables, qu'il a appelées spacers. Mojica a persévéré dans l'étude de ces séquences pendant des années, remarquant qu'elles étaient conservées entre différentes espèces et que les spacers provenaient souvent d'ADN étranger, notamment de virus et de plasmides. Il a émis l'hypothèse que le CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) pourrait être un système immunitaire bactérien, capable de mémoriser et de se défendre contre des infections virales antérieures. Parallèlement aux travaux de Mojica, d'autres chercheurs ont commencé à identifier des gènes associés aux séquences CRISPR, appelés gènes cas (CRISPR-associated). Ruud Jansen et ses collègues ont été parmi les premiers à identifier et nommer ces gènes cas. L'analyse bioinformatique, notamment par Eugene Koonin et ses collaborateurs, a révélé que les gènes cas codaient pour des protéines ayant des similitudes avec des nucléases et des hélicases, suggérant un rôle dans l'interaction avec l'ADN. La preuve définitive que le CRISPR-Cas était un système immunitaire adaptatif est venue des travaux de Rodolphe Barrangou et Philippe Horvath chez Danisco (ensuite DuPont). En étudiant Streptococcus thermophilus, une bactérie utilisée dans la production de yaourt et de fromage, ils ont montré en 2007 que les bactéries pouvaient acquérir une résistance aux phages (virus bactériens) en intégrant de nouvelles séquences spacers dérivées du génome viral dans leurs loci CRISPR. Ils ont également démontré que la suppression de spacers spécifiques rendait les bactéries à nouveau sensibles aux phages correspondants. C'était la confirmation expérimentale que le  système CRISPR-Cas fonctionnait comme un système immunitaire bactérien acquis. Plusieurs types de systèmes CRISPR-Cas ont été découverts, classés en deux classes principales. Les systèmes de classe 2, en particulier le système CRISPR-Cas9 de Streptococcus pyogenes, se sont avérés particulièrement intéressants en raison de leur simplicité. Cas9 est une seule protéine qui, guidée par un ARN, peut couper l'ADN à un site spécifique. La percée majeure qui a transformé le CRISPR-Cas9 en un outil de modification génomique révolutionnaire est survenue en 2012. Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier, avec leurs équipes, ont publié un article fondamental démontrant que Cas9 pouvait être reprogrammé pour couper l'ADN à n'importe quel endroit désiré. Elles ont montré qu'en modifiant l'ARN guide, il était possible de cibler Cas9 sur des séquences d'ADN spécifiques in vitro. Parallèlement, le laboratoire de Feng Zhang a rapidement adapté le système CRISPR-Cas9 pour l'édition de gènes dans des cellules de mammifères, et notamment des cellules humaines. Ces découvertes ont déclenché une révolution dans la biologie et la biotechnologie. La simplicité, l'efficacité et la polyvalence de la technique CRISPR-Cas9 ont permis aux scientifiques de modifier les gènes avec une précision sans précédent, ouvrant de nouvelles voies pour la recherche fondamentale, le développement de thérapies géniques, l'amélioration des cultures et bien d'autres applications. 

Grâce à cette technologie, il est possible de modifier le génome d'organismes divers, des bactéries aux plantes, en passant par les animaux et les cellules humaines. Elle a de nombreuses applications en recherche fondamentale, en médecine (notamment pour corriger des mutations génétiques responsables de maladies), en agriculture (plantes génétiquement modifiées) et en biotechnologie. Toutefois, son usage soulève des questions éthiques, surtout lorsqu'il s'agit de modifications dans les cellules germinales humaines, transmissibles à la descendance.

Les composants principaux.
Pour comprendre son fonctionnement, il faut décortiquer ses deux principaux composants : l'enzyme Cas9 et le guide ARN (gARN).

L'enzyme Cas9.
Cas9 est une enzyme, plus précisément une nucléase, ce qui signifie qu'elle a la capacité de couper l'ADN à la manière d' une paire de ciseaux moléculaires très précis. Cependant, Cas9 ne coupe pas l'ADN au hasard. Elle a besoin d'être guidée vers un endroit spécifique du génome pour exercer son action. C'est là qu'intervient le guide ARN.

Le guide ARN (gARN).
Le guide ARN est une courte séquence d'ARN synthétique conçue pour être complémentaire à la séquence d'ADN que l'on souhaite cibler. En d'autres termes, le guide ARN est une sorte d'adresse moléculaire qui indique à Cas9 où aller couper. Il est composé de deux parties essentielles : une séquence d'environ 20 nucléotides qui correspond à la séquence cible dans l'ADN et une structure plus longue et constante qui se lie à Cas9.

Le processus.
Le processus commence par la conception du guide ARN. Les chercheurs identifient la séquence d'ADN qu'ils souhaitent modifier et conçoivent un guide ARN dont la séquence de 20 nucléotides est complémentaire à cette séquence cible. Ce guide ARN synthétique est ensuite introduit dans la cellule, généralement en même temps que l'enzyme Cas9. Dans la cellule, Cas9 et le guide ARN forment un complexe. Le guide ARN, par sa séquence de 20 nucléotides, va explorer le génome cellulaire à la recherche de la séquence d'ADN complémentaire. Une caractéristique cruciale du système CRISPR-Cas9 est la nécessité d'une courte séquence d'ADN appelée PAM (Protospacer Adjacent Motif) située juste après la séquence cible dans l'ADN. 

Le PAM est une séquence spécifique (par exemple, NGG pour le système Cas9 le plus couramment utilisé, où N représente n'importe quel nucléotide et G la guanine) qui est reconnue par Cas9. Le PAM agit comme un signal de reconnaissance pour Cas9, indiquant que la séquence adjacente est une cible potentielle. Sans PAM, Cas9 ne peut pas se lier et couper l'ADN, même si le guide ARN est parfaitement complémentaire à la séquence d'ADN.

Les voies de réparation.
La cellule, face à une coupure double brin dans son ADN, active des mécanismes de réparation pour réparer les dommages. Il existe principalement deux voies de réparation : la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ,  non-homologous end joining) et la réparation dirigée par homologie (HDR, homology-directed repair).

• La NHEJ est la voie de réparation la plus fréquente. Elle est rapide mais souvent imprécise. Lors de la NHEJ, les extrémités de l'ADN coupées sont directement réunies, mais ce processus peut souvent entraîner des insertions ou des délétions de quelques nucléotides au site de la coupure. Ces insertions ou délétions, appelées indels, peuvent perturber le cadre de lecture du gène si la coupure se produit dans une région codante, ce qui peut inactiver le gène. C'est ainsi que CRISPR-Cas9 peut être utilisé pour "éteindre" un gène, une technique appelée knock-out.

• La HDR est une voie de réparation moins fréquente mais plus précise. Elle utilise une matrice d'ADN homologue, c'est-à-dire une séquence d'ADN similaire à la région endommagée, pour guider la réparation. Cette matrice d'ADN homologue peut être fournie à la cellule de manière exogène, par exemple sous forme de plasmide contenant une séquence d'ADN modifiée que l'on souhaite insérer au site de la coupure. Lorsque la HDR est activée, la cellule utilise cette matrice pour réparer la coupure, ce qui permet d'insérer une nouvelle séquence d'ADN précise au site de la coupure, voire de remplacer une séquence existante par une autre.